Expression, purification and evaluation of recombinant L-asparaginase in mehthylotrophic yeast Pichia pastoris

Biểu hiện, tinh sạch và đánh giá hoạt tính của L-asparaginase tái tổ hợp trong nấm men Pichia pastoris

Abstract

L-asparaginase (EC 3.5.1.1), a therapeutic enzyme used in the treatment of childhood acute lymphoblastic leukemia (ALL). Hence, the goal of this work is study the expression and evaluation of hydrolysis activity of native sequence (X12746) encoding for L-asparaginase from Erwinia chrysanthemi NCPBB1125 in the popular expression system Pichia pastoris. The sequence of asn encoded for mature protein was expressed in P. pastoris SMD1168 and X33. SDS-PAGE analysis showed recombinant L-asparaginase was secreted efficiently. Stable and high hydrolysis activity of extracellular L-asparaginase in P. pastoris SMD1168 making it a potential candidate to produce recombinant protein. After purification, a specific band whose appearance approximately 45 kDa indicating the glycosylated protein with specific activity by 6.251 Umg^-1 and about 3 folds purifications.

L-asparaginase (EC 3.5.1.1), một loại enzyme được sử dụng trong điều trị bệng ung thư bạch cầu mãn tính ở trẻ em. Mục tiêu của nghiên cứu này là biểu hiện và đánh giá hoạt tính thủy phân của L-asparaginase mã hóa bởi đoạn gene (X12746) tương ứng từ Erwinia chrysanthemi NCPBB1125 được biểu hiện trong nấm men Pichia pastoris. Gene đã được cắt signal peptide và biểu hiện trong P. pastoris SMD1168 and X33. Qua phân tích kết quả điện di SDS-PAGE của môi trường sau lên men, L-asparaginase tái tổ hợp được tìm thấy trong dịch ngoại bào của P. pastoris. Với khả năng sản xuất protein có hoạt tính cao hơn so với chủng P. pastoris X33, SMD1168 được lựa chọn để biểu hiện L-asparaginase tái tổ hợp. Sau khi tinh sạch, sự xuất hiện của một băng có kích khối lượng phân tử xấp xỉ 45 kDa trên điện di SDS-PAGE cho thấy protein tái tổ hợp đã bị glycosyl hóa với hoạt tính riêng 6.251 Umg^-1 và đạt độ sạch 3.471 lần.